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高效液相色譜及高效液相的分離原理是什么呢？

  高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC，又稱為“高壓液相色譜和高分離度液相色譜等"）是一項(xiàng)重要的分析分離技術(shù)，用于分離和鑒定混合物中的多種組分，并對(duì)各種組分進(jìn)行定量分析。 HPLC采用高壓輸送系統(tǒng)，將含有樣品溶液的不同極性的（單一或不同比例混合）溶劑和流動(dòng)相泵入填充有固定吸附材料的色譜柱中。樣品中不同組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在色譜柱中做相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過(guò)程，使不同組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大差別，從而實(shí)現(xiàn)分離。

為什么色譜峰會(huì)出現(xiàn)拖尾？

1. 樣品溶劑極性過(guò)強(qiáng)——解決辦法：確保樣品溶劑極性低于或者等同于流動(dòng)相極性；

2. 色譜柱超載——解決辦法：減少進(jìn)樣體積或減小進(jìn)樣濃度；

3. 篩板堵塞或柱失效——解決辦法：反向沖洗色譜柱，替換篩板或更換色譜柱；

4. 存在干擾峰——解決辦法：使用更長(zhǎng)的色譜柱，或更換流動(dòng)相，或更換選擇性更好的色譜柱；

5. 色譜柱塌陷、污染等色譜柱本身的問(wèn)題——解決辦法：更換色譜柱。

為什么色譜峰出現(xiàn)雙峰或分叉？

色譜雙峰指的是一種物質(zhì)在一張色譜圖中出現(xiàn)兩個(gè)峰。這種情況可能由于：

1. 溶劑極性及進(jìn)樣量——解決辦法：當(dāng)溶劑的極性與流動(dòng)相的極性相差非常大也可能出現(xiàn)雙峰，將進(jìn)樣量減少一半以上；當(dāng)進(jìn)樣量不大，但是濃度很大時(shí)，則考慮是色譜柱過(guò)載，將樣品稀釋后再進(jìn)樣；

2. 樣品體積過(guò)大——解決辦法：用流動(dòng)相配樣，總的樣品體積小于第一峰的15%；

3. 流動(dòng)相比例不合適——解決辦法：調(diào)節(jié)有機(jī)相比例；

4. 樣品溶劑極性過(guò)強(qiáng)——解決辦法：采用較弱的樣品溶劑；

5. 樣品的特性——解決辦法：動(dòng)態(tài)平衡的互變異構(gòu)現(xiàn)象，如紅霉素；

6. 色譜柱——解決辦法：原色譜峰出現(xiàn)雙峰且一大一小，可以判斷色譜柱柱頭受堵，將色譜柱反過(guò)來(lái)接，用流動(dòng)相沖洗或用酸洗或其他試劑；

7. 柱塌陷或形成短路通道——解決辦法：更換色譜柱，采用較弱腐蝕性條件；

8. 柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效——解決辦法：更換燒結(jié)不銹鋼，加在線過(guò)濾器，過(guò)濾樣品。

為什么色譜圖中出現(xiàn)“鬼峰"？

當(dāng)色譜圖上出現(xiàn)比較雜亂且詭異的峰時(shí)我們稱它為“鬼峰"。這種情況可能由于：

1. 上次進(jìn)樣的殘留——解決辦法：用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，并用初始流動(dòng)相平衡色譜柱30 min及以上；

2. 溶劑中有氣泡——解決辦法：溶劑脫氣；

3. 樣本中存在不明干擾物——解決辦法：樣本凈化或預(yù)分離；

4. 色譜柱未平衡——解決辦法：重新平衡色譜柱，用流動(dòng)相作樣品溶劑（尤其是離子對(duì)色譜）；

5. （TFA）氧化——解決辦法：每天新配，用抗氧化劑；

6. 溶劑污染——解決辦法：使用新配制的HPLC級(jí)溶劑，梯度方法常表現(xiàn)為“鬼峰"。

為什么色譜峰峰型展寬，變成“矮胖型"？

色譜圖在正常的情況下是“瘦高型"的，變成“矮胖型"是色譜峰峰型展寬導(dǎo)致。這種情況可能由于：

1. 柱子沒(méi)有平衡好——解決辦法：用流動(dòng)相重新平衡色譜柱；

2. 樣本溶劑極性過(guò)強(qiáng)——解決辦法：確保樣品溶劑低于或者等同于流動(dòng)相的強(qiáng)度；

3. 進(jìn)樣量過(guò)大——解決辦法：減少進(jìn)樣體積，避免樣品過(guò)載；

4. 進(jìn)樣濃度過(guò)大——解決辦法：減少進(jìn)樣濃度，避免樣品過(guò)載；

5. 流動(dòng)相比例不合適——解決辦法：調(diào)節(jié)有機(jī)相比例；

6. 溫度波動(dòng)——解決辦法：使用恒溫控制的柱溫箱，溫度越高峰形越尖銳；

7. 流動(dòng)相粘度太高——解決辦法：增加柱溫；

8. 保留時(shí)間長(zhǎng)——解決辦法：用梯度洗脫或更強(qiáng)的流動(dòng)相；更換短的色譜柱；

9. 色譜柱塌陷——解決辦法：更換新的色譜柱；

10. 檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)慢——解決辦法：調(diào)節(jié)時(shí)間常數(shù)使之與峰寬匹配。

為什么色譜圖中出現(xiàn)倒峰？

1. 常為溶劑峰，樣本的溶劑的極性和光吸收度與流動(dòng)相相差很大，而進(jìn)樣量又較大的話，樣本的溶劑不能和流動(dòng)相充分混合均勻，溶劑被洗脫形成一個(gè)峰，如果溶劑的紫外吸收比流動(dòng)相小，就會(huì)出現(xiàn)負(fù)峰；或流動(dòng)相加了有一定紫外吸收的添加劑，而樣品中含有無(wú)紫外吸收的無(wú)機(jī)鹽或其它物質(zhì)時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)負(fù)峰——解決辦法：用流動(dòng)相作為樣本溶劑，使用高純度的溶劑作為流動(dòng)相；

2. 折光檢測(cè)器：溶質(zhì)折射率小于溶劑折射率——解決辦法：無(wú)誤；將極性調(diào)反使之為正；

3. 樣品中的雜質(zhì)沒(méi)有紫外處吸收或吸收很小，而流動(dòng)相紫外吸收大時(shí)，如用甲醇時(shí)波長(zhǎng)設(shè)定在220nm以下時(shí)，常出現(xiàn)這種現(xiàn)象；

4. 進(jìn)樣過(guò)程中進(jìn)入了空氣也會(huì)導(dǎo)致的。

用液相測(cè)定多種物質(zhì)時(shí)，怎樣可以使色譜圖中的色譜峰位發(fā)生重排呢？

在分析多組分樣品時(shí)，僅改變流動(dòng)相的強(qiáng)度（組成百分比）而不改變其組成，一般僅僅改變所有組分的保留時(shí)間，不會(huì)發(fā)生峰位的重排。以下條件的改變可能發(fā)生峰位重排：

1. 流動(dòng)相中換了強(qiáng)溶劑；

2. PH值的改變；

3. 色譜柱填料的改變；

4. 柱溫的改變；

5. 流動(dòng)相的組成改變（如加入離子對(duì)試劑三乙基胺等）。