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Mouse IL-6 ELISA KIT目       錄

背景介紹………………………………………………………………………………

檢測原理………………………………………………………………………………

注意事項………………………………………………………………………………

安全提示………………………………………………………………………………

試劑盒組成及儲存……………………………………………………………………

自備實驗器材…………………………………………………………………………

樣品收集及儲存………………………………………………………………………

試劑準備………………………………………………………………………………

檢測步驟………………………………………………………………………………

結(jié)果判斷………………………………………………………………………………

參數(shù)表征………………………………………………………………………………

參考文獻………………………………………………………………………………

常見問題分析及解決辦法……………………………………………………………

Mouse IL-6 ELISA KIT背景介紹：

白細胞介素-6（IL-6）是由纖維母細胞、單核/巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞、上皮細胞、角質(zhì)細胞、以及多種瘤細胞所產(chǎn)生。IL-1、TNF-a, PDGF、病毒感染、雙鏈RNA及c AMP等，均可誘導(dǎo)正常細胞產(chǎn)生白介素6。白介素6能夠刺激參與免疫反應(yīng)的細胞增殖、分化并提高其功能。IL-6由2條糖蛋白鏈組成；1條為α鏈，分子量80KD；另1條為β鏈，分子量130KD。α鏈缺少胞內(nèi)區(qū)，只能以低親合性與IL-6結(jié)合，所形成的復(fù)合物迅即與高親和性的β鏈結(jié)合，通過β鏈向細胞內(nèi)傳遞信息。IL-6主要有以下生物特性：誘導(dǎo)B細胞分化；支持漿細胞瘤和骨髓瘤增生；誘導(dǎo)IL-2和IL-2受體表達；誘導(dǎo)單核細胞分化；誘導(dǎo)CTL；增強NK細胞活性；誘導(dǎo)急性期反應(yīng)分子并刺激肝細胞；誘導(dǎo)神經(jīng)元分化；誘導(dǎo)腎小球膜細胞生長；誘導(dǎo)角質(zhì)化細胞生長。

檢測原理：

    Solarbio (Solarbio ®)ELISA試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)。將抗小鼠IL-6單克隆抗體包被在酶標板上；分別加入梯度稀釋的標準品和預(yù)稀釋的樣本，標準品和樣本中的小鼠IL-6會與酶標板上的包被抗體充分結(jié)合；洗板后加入生物素化抗小鼠IL-6抗體，該抗體會與板子上包被抗體捕獲的標準品和樣本中的小鼠IL-6發(fā)生特異性結(jié)合；洗板后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉親和素，生物素與鏈霉親和素會發(fā)生高強度的非共價結(jié)合；洗板后加入顯色劑底物TMB，若反應(yīng)孔中樣品存在不同濃度的小鼠IL-6，則HRP會使無色TMB變成不同深淺（正相關(guān)）的藍色物質(zhì)，加入終止液后反應(yīng)孔會變成黃色；后，在λmax=450 nm（OD=450 nm）處測定反應(yīng)孔樣品吸光度（OD），樣本中的小鼠IL-6濃度與OD成正比，通過繪制標準曲線和四參數(shù)擬合軟件便可計算出樣本中小鼠IL-6的濃度。

注意事項：※※※

1. 試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用，請不要使用過期的試劑。

2. 試劑盒未使用時應(yīng)保存在2-8℃冰箱，已復(fù)溶但未用完的標準品，請丟棄。

3. 試劑盒使用前請在室溫恢復(fù)30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。

4. 在試驗中標準品和樣本建議作復(fù)孔檢測，且加入試劑的順序應(yīng)保持*。

5. 為避免交叉污染，請在試驗中使用1次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。.

6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶 

蓋上，使用前請離心處理（5-10 S即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時，請用移液器小心吹打幾次。

7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的 試劑代替本試劑盒中的某單個組分。

8. 為保證結(jié)果準確，每次檢測均需做標準曲線。

安全提示：試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護；在操作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時，請按國家生物實驗室安全防護有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行。

試劑盒組成及儲存：

自備實驗器材（不提供，可代購）

1． 酶標儀（主波長450nm，參考波長630nm）

2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl

3． 洗板機或洗瓶

4． 37℃孵育箱

5． 雙蒸水，去離子水，量筒等

6． 稀釋用聚丙烯試管

樣本收集及儲存：

1. 細胞培養(yǎng)上清：

將細胞培養(yǎng)基移無菌離心管，在4℃條件下1000×g離心10 min,然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時內(nèi)檢測可放入2-8℃儲存），避免反復(fù)凍融。

2. 血清樣本：

室溫血液自然凝固20 min后，在4℃條件下1000×g離心10 min，然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時內(nèi)檢測可放入2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀，請再次離心，避免反復(fù)凍融。

3. 血漿樣本：

將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據(jù)標本的實際要求選擇EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合20 min，在4℃條件下1000×g離心10 min，然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時內(nèi)檢測可放入2-8℃儲存），避免反復(fù)凍融。

※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結(jié)果；如果樣本中的靶標物檢測濃度高于標準品的高值，請將樣品做適當倍數(shù)稀釋后檢測，建議正式實驗前做預(yù)實驗以確定稀釋倍數(shù)。

試劑準備：

1. 試劑回溫：先在實驗前30 min將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶，請放入37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解。

2. 配制洗滌液：預(yù)先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將20倍濃縮洗滌液稀釋成1倍應(yīng)用液，未用完的濃縮洗滌液放入4℃冰箱保存。

3. 標準品梯度稀釋：加入標準品/樣本稀釋液（SR1）1ml凍干標準品中，靜置15分鐘待其*溶解后輕輕混勻(濃度為1000pg/ml)，用移液器吸出溶解好的標準品原液250ul,加入750ul標準品/樣本稀釋液（SR1）(濃度為250pg/ml)，然后按照以下濃度：250、125、62.5、31.25、15.625、7.8、3.9、 0 pg/ml進行稀釋。復(fù)溶過的標準品原液（1000pg/ml）未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。

4. 生物素化抗體工作液：預(yù)先計算好試驗所需用量，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前充分混勻），請在30分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中。

生物素化抗體工作液具體稀釋方法如下：

5. 酶結(jié)合物工作液：按每次試驗所需用量配制，用酶結(jié)合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前離心），請在30分鐘內(nèi)使用。

酶結(jié)合物工作液具體稀釋方法如下：

6. 洗滌方法：

l 自動洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為300ul/孔,注與吸出間隔為30秒，洗板5次。

l 手工洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液300ul/孔，靜止30秒后甩凈酶標板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板5次。

結(jié)果判斷：

1.用酶標儀 450 nm 波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測，參考波長為 630 nm。如不能進行雙波長檢測，請用 450 nm 的OD測定值減去630 nm的OD測定值。

2.計算標準品、樣品的平均OD值：每個標準品和標本的OD值應(yīng)減去零孔的OD值

3.以標準品濃度為橫坐標，吸光度OD值為縱坐標，用軟件繪制標準曲線，樣品中IL-6含量可通過對應(yīng)OD值由標準曲線換算出相應(yīng)的濃度。

4.若標本OD值高于標準曲線上限，應(yīng)做適當稀釋后重新檢測，計算濃度時再乘以稀釋倍數(shù)。

參數(shù)表征：

1. 數(shù)據(jù)及標準曲線

本圖僅供參考，應(yīng)以當次試驗標準品繪制的標準曲線計算小鼠IL-6的樣本含量

2. 靈敏度：

低可檢測小鼠IL-6濃度達2pg/ml，

20個零標準品濃度OD的平均值加上兩個標準差，計算相應(yīng)的可檢測濃度。

3. 特異性：

不與小鼠CT-1、 gp130、 IL-11、 LIF反應(yīng)，人的IL-6、IL-6 sR 等反應(yīng)

4. 重復(fù)性：

板內(nèi)，板間變異系數(shù)<10%

5. 回收率：

在選取的健康小鼠血漿、細胞培養(yǎng)上清中加入 3 個不同濃度水平的小鼠 IL-6，計算回收率。

6. 線性稀釋：

分別在選取的4 份健康小鼠血漿和細胞培養(yǎng)上清中加入高濃度小鼠 IL-6，在標準曲線動力學(xué)范圍內(nèi)進行稀釋，評估線性。